Во время ежегодного праздника больше всего бросается в глаза эпидемия коронавируса.
Друзья по очереди спрашивали, есть ли способ избежать заражения?
Основные защитные работы, ношение масок, частое мытье рук ... Кроме
энергетического уровня, необходимо «поднять собственную частоту вибраций».
Черный чай и зеленый чай , анти- коронавирус !
Друзья, которые пристрастились к кофе / чаю в пакетиках, зеленому чаю, могут недавно перейти на черный чай или зеленый.
Растения всегда оказывают своевременную помощь, когда люди этого не ожидают. Теафлавины (TF3), содержащиеся в черном чае и пуэр, не только придают глубокий цвет черному чаю, но и предотвращают репликацию коронавируса . Улун и зеленый чай не имеют такого эффекта.
Японцы действительно сильны. Черный чай Тосуми, разработанный промышленностью, правительством и академическими кругами, содержит клетчатку для увеличения TF3 в 2–3 раза. Первоначально он был направлен на борьбу с вирусом гриппа, но теперь он используется для борьбы с коронавирусом . Также есть леденцы, содержащие TF3 ~~ Вы можете съесть больше.
Ингибирование активности 3C-подобной протеазы SARS-CoV теафлавин-3,3'-дигаллатом (TF3)
Ингибирование теафлавин-3,3'-терефталата (TF3) на активность 3C-подобной протеазы SARS-CoV
SARS-CoV является возбудителем тяжелого острого респираторного синдрома (SARS). Кодируемая вирусом 3C-подобная протеаза (3CLPro) считается важной для репликации вируса SARS-CoV в инфицированных клетках-хозяевах. В этом исследовании мы проверили библиотеку натуральных продуктов, состоящую из 720 соединений, которые обладают ингибирующей активностью против 3CLPro. Было обнаружено, что два соединения обладают ингибирующим действием в библиотеке: дубильная кислота (IC50 = 3 мкМ) и 3-изотефлафлавин-3-галлат (TF2B) (IC50 = 7 мкМ). Эти два соединения относятся к группе природных полифенолов, содержащихся в чае. Мы дополнительно изучили ингибирующую активность 3CLPro экстрактов нескольких различных типов чая (включая зеленый чай, чай улун, чай пуэр и черный чай). Наши результаты показывают, что экстракты чая Pu и черного чая более эффективны, чем зеленый чай или чай улун, в ингибировании 3CLPro. Было также проверено, что несколько других известных композиций в чае подавляют активность 3CLPro. Мы обнаружили кофеин, (-) - галлат эпигаллокатехина (EGCg), эпикатехин (EC), теофиллин (TP), катехин (C), эпикатехин. Эфир галловой кислоты (ЭКГ) и эпигаллокатехин (ЭГК) не ингибируют активность 3CLPro. Было обнаружено, что только теафлавин-3,3'-терефталат (TF3) является ингибитором 3CLPro. Это исследование привело к идентификации новых соединений, которые являются эффективными ингибиторами 3CLPro.
SARS-CoV является возбудителем тяжелого острого респираторного синдрома (SARS). Кодируемая вирусом 3C-подобная протеаза (3CLPro) считается критически важной для вирусной репликации SARS-CoV в инфицированных клетках-хозяевах. В этом исследовании мы провели скрининг библиотека природных продуктов, состоящая из 720 соединений для ингибирующей активности против 3CLPro. Было обнаружено, что два соединения в библиотеке являются ингибирующими: дубильная кислота (IC50 = 3 мкМ) и 3-изотеафлавин-3-галлат (TF2B) (IC50 = 7 мкМ). Эти два соединения принадлежат к группе природных полифенолов, содержащихся в чае. Мы дополнительно исследовали 3CLPro-ингибирующую активность экстрактов из нескольких различных типов чая, включая зеленый чай, чай улун, чай пуэр и черный чай.Наши результаты показали, что экстракты пуэра и черного чая были более эффективными, чем экстракты зеленого чая или чая улун, по своей ингибирующей активности против 3CLPro. Несколько других известных композиций в чае также оценивались на предмет их активности в ингибировании 3CLPro. Мы обнаружили, что кофеин, ) -эпигаллокатехин галл (EGCg), эпикатехин (EC), теофиллин (TP), катехин (C), эпикатехин галлат (ЭКГ) и эпигаллокатехин (EGC) не ингибируют активность 3CLPro. Только теафлавин-3,3'-дигаллат (TF3) ) было обнаружено, что это ингибитор 3CLPro.Это исследование привело к идентификации новых соединений, которые являются эффективными ингибиторами 3CLPro.эпикатехин галлат (ЭКГ) и эпигаллокатехин (EGC) не подавляли активность 3CLPro. Было обнаружено, что только теафлавин-3,3'-дигаллат (TF3) является ингибитором 3CLPro. Это исследование привело к идентификации новых эффективных соединений 3CLPro. ингибиторы.эпикатехин галлат (ЭКГ) и эпигаллокатехин (EGC) не подавляли активность 3CLPro. Было обнаружено, что только теафлавин-3,3'-дигаллат (TF3) является ингибитором 3CLPro. Это исследование привело к идентификации новых соединений, которые являются эффективными 3CLPro ингибиторы.
Введение:
Тяжелый острый синдром Huxijitong (SARS), вызванный недавно обнаруженным коронавирусом SARS coronavirus (SARS-CoV), вызванный (1, 2). С 1 ноября 2002 г. по 18 июня 2003 г. Всемирная организация здравоохранения из 29 стран сообщила в общей сложности о 8 465 возможных случаях атипичной пневмонии, и 801 человек умер от этой болезни. Летальность составляет около 10%. Хотя распространения вируса удалось избежать, повторное появление SARS все еще остается под вопросом (3-6).
Как и другие родственные коронавирусы , SARS-CoV - это вирус с оболочкой, который содержит одноцепочечную РНК с положительной полярностью. Коронавирус - самый крупный из известных геномов (около 30 т.п.н.) среди РНК-вирусов [7]. Геном SARS-CoV содержит открытую рамку считывания (ORF), которая кодирует два перекрывающихся полипротеина репликазы полипротеин-1a (pp1a, около 450 кДа) и poplyprotein-1ab (pp1ab, около 750 кДа). Отвечает за репликацию вируса (7). Остальная часть генома включает не менее пяти ORF, кодирующих структурные белки и другие гены с предполагаемыми функциями (8, 9). Протеолитический процесс, особенно процесс репликации ферментного полипротеина, является одним из ключевых этапов жизненного цикла многих вирусов РНК с положительной цепью (включая коронавирусы ). Все коронавирусы кодируют пролиноподобную протеазу (PLP) и химотрипсиноподобную протеазу (3CLPro), используемые в протеолитическом процессе во время созревания вируса (10). Исследования на других коронавирусах показали, что белок PLP расщепляет не менее двух сайтов на полипротеине pp1a, в то время как протеаза 3CLPro расщепляет не менее 11 междоменных сайтов на полипротеинах pp1a и pp1ab [7]. Следовательно, протеаза 3CLPro SARS-CoV считается важной молекулярной мишенью для открытия и разработки лекарств против SARS-CoV. В этом исследовании путем скрининга библиотеки натуральных продуктов и дальнейшего подтверждения мы обнаружили, что SARS-3CLPro может подавляться соединениями, богатыми чаем. Мы также исследовали ингибирующую активность различных чаев и сырых экстрактов группы репрезентативных натуральных продуктов в чае против SARS-3CLPro.
Тяжелый острый респираторный синдром (SARS) вызван недавно обнаруженным коронавирусом SARS coronavirus (SARS-CoV) (1,2). С 1 ноября 2002 г. по 18 июня 2003 г. в общей сложности было зарегистрировано 8465 возможных случаев заболевания SARS. Всемирная организация здравоохранения из 29 стран, и 801 человек умер от этого заболевания. Доля случаев и летальных исходов составила ∼10%. Хотя распространение вируса удалось предотвратить, повторное появление SARS все еще остается под вопросом (3–6) .
Как и другие родственные коронавирусы, SARS-CoV представляет собой оболочечный вирус, содержащий одноцепочечную РНК положительной полярности. Коронавирусы имеют самые большие известные геномы (∼30 т.п.н.) среди РНК-вирусов [7]. Геном SARS-CoV включает одну открытую рамку считывания. (ORF), кодирующие два перекрывающихся полипротеина репликазы, полипротеин-1a (pp1a, ∼450 кДа) и poplyprotein-1ab (pp1ab, ∼750 kDa), ответственные за репликацию вируса (7). Остальная часть генома включает по крайней мере пять ORF, кодирующих структурные белки и другие гены с предполагаемыми функциями (8,9) .Протеолитический процессинг, особенно процессинг полипротеинов репликазы, является одним из важнейших этапов жизненного цикла многих вирусов с положительной цепью РНК, включая коронавирусы.Все коронавирусы кодируют паплиноподобную протеазу (PLP) и химотрипсиноподобную (3CLPro) протеазу для протеолитического процесса во время созревания вируса (10). Исследования на других коронавирусах показали, что белок PLP расщепляется не менее чем на двух участках на pp1a полипротеин и что протеаза 3CLPro расщепляет по меньшей мере 11 междоменных сайтов на полипротеинах pp1a и pp1ab [7]. Таким образом, протеаза 3CLPro SARS-CoV считается важной молекулярной мишенью для открытия лекарств против SARS-CoV и В этом исследовании после скрининга библиотеки натуральных продуктов и дальнейшего подтверждения мы обнаружили, что SARS-3CLPro может подавляться соединениями, которых много в чаях. Мы также исследовали неочищенные экстракты из различных чаев и группу репрезентативных натуральных продуктов в чаи за их ингибирующую активность против SARS-3CLPro.
Приготовление SARS-CoV 3CLPro
Общая РНК, выделенная из мазков из зева у пациентов с SARS, была предоставлена Центром контроля заболеваний (CDC) в Тайбэе, Тайвань. Все образцы РНК обрабатываются в соответствии с требованиями уровня биобезопасности 2 (BSL2). Два праймера, а именно 5'-GGCGGAATTCGCCTCTACCAACCACCACAGA-3 'и 5'-GGCGGAATTCA AAGCATCCAATGATGATGAGTGCC-3', были использованы в полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (RT-PCR), а метод Ready-to-Go RT-SARS-3 был использован для синтеза ProCL. кДНК. Согласно протоколу производителя, шарики для ПЦР (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Циклы ПЦР, используемые для амплификации кДНК SARS-3CLPro, следующие: 94 ° C в течение 5 минут, 25 циклов при 94 ° C в течение 1 минуты, 58 ° C в течение 3 минут, 72 ° C в течение 2 минут и 72 ° C. C длится 10 минут. Полноразмерный 3CLPro коронавируса SARS успешно экспрессируется в E. coli в виде слитого белка глутатион-S-трансферазы (GST). После расщепления тромбином 3CLPro очищали до гомогенности. Был синтезирован 15-мерный пептид с последовательностью H2N-SITSAVLQSGFRKMA-COOH, соответствующей сайту авторасщепления SARS-3CLPro, и использован для определения активности расщепления протеазой. Анализ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показывает, что высокоочищенный белок обладает транс-протеолитической активностью.
Композитный набор
Библиотека Pure Natural Products, используемая для скрининга на ингибирование 3CLPro, была получена от MicroSource Discovery Systems, Inc., Gaylordsville, CT. Он содержит уникальную коллекцию из 720 чистых натуральных продуктов. Коллекция включает простые и сложные кислородные гетероциклы, алкалоиды, гептатерпены, дитерпены, пентациклические тритерпены, стерины и многие другие различные представители. Первоначально было собрано 10 различных соединений и протестировано на их ингибирующую активность против SARS-3CLPro. Затем положительную библиотеку деконволюционируют, и одно чистое соединение, которое может ингибировать расщепление пептида более чем на 50% при 10 мкМ, регистрируется как попадание. Другие соединения были получены от Sigma (Сент-Луис, Миссури). Теафлавин (TF1), TF2 [TF-2A (теафлавин-3-галлат) и TF-2B (смесь теафлавин-3'-галлата)] и теафлавин-3,3'-дигаллат (TF3) хороши для Dr Гифт Лян Юйчжи, медицинский факультет Тайбэйского медицинского университета, Тайвань, Китайская Республика.
Приготовление сырых экстрактов чая улун, зеленого чая, черного чая и чая пуэр
Чайная жидкость изготовлена из образцов чая улун, зеленого чая, черного чая и чая пуэр (также известного как чай пу или чай пу) с содержанием 2% (вес / объем). Водные экстракты четырех различных типов чайных листьев были приготовлены встряхиванием в кипящей горячей воде в течение 10 минут в термоколбе. Затем экстракт фильтровали через фильтр Millex-GS 0,22 мкм (Millipore, Marsheim, Франция) для удаления твердых частиц. Затем водный экстракт упаривали при пониженном давлении, чтобы получить вязкое вещество. Оценить ингибирующую активность этих материалов на SARS-3CLPro.
Ингибирование активности протеазы SARS-3CLPro с помощью ВЭЖХ
Универсальный ингибитор цистеиновой протеазы N-этилмалеимид (NEM, ингибитор протеазы в качестве положительного контроля) был получен от Sigma (Сент-Луис, Миссури). Ингибирующая активность этого соединения в отношении SARS-3CLPro была проверена в тесте пептидного расщепления. Активность протеазы измеряют в отсутствие или в присутствии различных концентраций этих универсальных ингибиторов. Предварительно инкубируйте фермент (2 мкМ) с химикатами в течение 30 минут. Затем к реакционной смеси добавляли 100 мкМ пептида и смесь инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа. Рассчитана эффективность ингибитора. Условия анализа ВЭЖХ: защитная колонка C18 RP (250 × 4,6 мм × 5 мкм, Agilent Zorbax Extend). Этот метод был выбран потому, что он обеспечивает лучшее разрешение среди нескольких методов тестирования. Температура колонки соответствует температуре окружающей среды с использованием системы растворителей, содержащей смесь растворителя A [10 MM NH4OAc, 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA)] и B (ацетонитрил, 0,1% TFA) для элюирования (0,8 мл / мин) из 100% A. Вначале он линейно падает до 10% A за 8 минут, линейно падает до 100% A за 16 минут и удерживается на уровне 100% A в течение 23 минут. Объем впрыска - 40 мл. УФ-детектор установлен на 214 нм.
Обнаружение протеолитической активности SARS-3CLPro по флуоресцентному субстрату пептида
Ранее сообщалось о разработке методов анализа активности флуоресцентных протеаз (7). Флуоресцентный микропланшет-ридер (Fluoroskan Ascent, от ThermoLabsystems, Швеция) использовали для возбуждения на 538 нм и отслеживания усиленной флуоресценции, вызванной расщеплением флуоресцентного пептида-субстрата (Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans), катализируемым протеазой на 538 нм. Флуоресцентный анализ используется для определения IC50 идентифицированных ингибиторов активности SARS 3CLPro. Протеаза перед использованием хранится в буфере -70 ° C. Буфер содержит 12 мМ трис-HCl (pH 7,5), 120 мМ NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 7,5 мМ 2-меркаптоэтанол и 1 мМ дитиотреозу. Алкоголь (DTT).
Р репарации SARS-CoV 3CLPro
Суммарная РНК, выделенная из мазка из горла пациента с SARS, была предоставлена Центром по контролю заболеваний (CDC), Тайбэй, Тайвань. Все образцы РНК обрабатывались в соответствии с правилами биологической безопасности уровня 2 (BSL2). Два праймера, 5'-GGCGGAATTCGCCTCTACCAACCACCACAGA -3 'и 5'-GGCGGAATTCA AAGCATCCAATGATGAGTGCC-3', были использованы для обратной транскрипции - полимеразной цепной реакции (RT - PCR) для синтеза кДНК SARS-3CLPro с использованием Ready-to-Go RT - PCR Beads (Amersham Biosciences, Piscataway , Штат Нью-Джерси) в соответствии с протоколом производителя.Цикл ПЦР, используемый для амплификации кДНК SARS-3CLPro, был следующим: 94 ° C в течение 5 минут, 25 циклов при 94 ° C в течение 1 минуты, 58 ° C в течение 3 минут, 72 ° C в течение 2 минут и 72 ° C в течение 10 минут. Полноразмерный 3CLPro коронавируса SARS был успешно экспрессирован в Escherichia coli в виде слитого белка глутатион-S-трансферазы (GST).После расщепления тромбином 3CLPro очищали до гомогенности. Был синтезирован 15-мерный пептид с последовательностью H2N-SITSAVLQSGFRKMA-COOH, соответствующей сайту авторасщепления SARS-3CLPro, и его использовали для анализа активности расщепления протеазой. Высокоочищенный белок продемонстрировал высокую анализ с помощью жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для выявления протеолитической активности в транс.
Сбор Соединения
Библиотека Pure Natural Products, используемая для скрининга ингибирования 3CLPro, была получена от MicroSource Discovery Systems, Inc., Гейлордсвилль, Коннектикут. Она состоит из уникальной коллекции из 720 чистых натуральных продуктов. Коллекция включает простые и сложные кислородные гетероциклы, алкалоиды, секвитерпены и др. дитерпены, пентациклические тритерпены, стерины и многие другие разнообразные представители. Первоначально были объединены 10 различных соединений, и смеси были протестированы на их ингибирующую активность против SARS-3CLPro. Положительные пулы затем деконволюционировали и были выделены отдельные чистые соединения, которые были способны ингибировать> 50 % расщепления пептида при 10 мкМ оценивали как совпадения. Другие соединения были получены от Sigma (Сент-Луис, Миссури). Теафлавин (TF1), TF2 [смесь TF-2A (теафлавин-3-галлат) и TF-2B ( теафлавин-3'-галлат)] и теафлавин-3,3'-дигаллат (TF3) был любезно подарен доктором Yu-Chih Liang, Школа медицинских технологий, Тайбэйский медицинский университет, Тайбэй, Тайвань, Китай.
Приготовление сырых экстрактов из чая улун, зеленого чая, черного чая и чая пуэр
Чайные настойки готовили из образцов чая улун, зеленого чая, черного чая и чая пуэр (также называемого пуэр или пуэр) в виде 2% (мас. / Об.) Чайных растворов. Водные экстракты четырех различных типов чайных листьев были готовили встряхиванием в течение 10 мин в кипящей горячей воде в термальных колбах. Затем экстракты фильтровали через фильтр Millex-GS 0,22 мкм (Millipore, Malsheim, Франция) для удаления твердых частиц. Затем водные экстракты выпаривали при пониженном давлении для получения Эти материалы были оценены на предмет их ингибирующей активности против SARS-3CLPro.
Ингибирование протеазной активности SARS-3CLPro методом ВЭЖХ
Общий ингибитор цистеиновой протеазы, N-этилмалеимид (NEM, ингибитор протеазы в качестве положительного контроля), был получен от Sigma (Сент-Луис, Миссури). Это соединение было протестировано на его ингибиторную активность против SARS-3CLPro в анализе пептидного расщепления. протеаз измеряли в отсутствие или в присутствии различных концентраций этих общих ингибиторов. Фермент (2 мкМ) предварительно инкубировали с химическими веществами в течение 30 мин. Затем к реакционной смеси добавляли пептид в концентрации 100 мкМ и смеси инкубировали при 37 ° C в течение 1 ч. Была рассчитана эффективность ингибиторов. Условия анализа ВЭЖХ: защитная колонка C18 RP (250 × 4,6 мм × 5 мкм, Agilent Zorbax Extend). Этот метод был выбран, потому что он давал наилучшее разрешение среди нескольких методов, которые были протестированы.Температура колонки была комнатной, а элюирование (0.8 мл / мин) выполняли с использованием системы растворителей, включающей растворители A [10 MM NH4OAc, 0,1% трифторуксусной кислоты (TFA)] и B (ацетонитрил, 0,1% TFA), смешанные с использованием градиента, начиная со 100% A, линейно уменьшающегося до 10 % A за 8 минут, до 100% A за 16 минут и выдержку при 100% A в течение 23 минут. Объем впрыска составлял 40 мл. УФ-детектор был установлен на 214 нм.
Протеолитическая активность SARS-3CLPro с помощью анализа пептидов флуорогенного субстрата
Ранее сообщалось о разработке флуоресцентного анализа активности протеаз (7). Усиленную флуоресценцию из-за расщепления флуорогенного пептида-субстрата (Dabcyl-KTSAVLQSGFRKME-Edans), катализируемого протеазой, наблюдали при 538 нм с возбуждением при 355 нм с использованием флуоресцентный планшет-ридер (Fluoroskan Ascent от ThermoLabsystems, Швеция). Флуориметрический анализ использовали для определения IC50 идентифицированных ингибиторов активности SARS 3CLPro. Протеаза хранилась в буфере, содержащем 12 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 120 мМ NaCl , 0,1 мМ ЭДТА, 7,5 мМ 2-меркаптоэтанол и 1 мМ дитиотреитол (ДТТ) при -70 ° C перед использованием.
Оценка чайных экстрактов и чистых ингредиентов чая, ингибирующих активность 3CLPro
Поскольку в различных чаях есть много других полифенолов, связанных с танином и TF2B, мы решили изучить ингибирующие эффекты различных чайных экстрактов и нескольких хорошо известных чистых ингредиентов чая на их активность. Поэтому были приготовлены водные экстракты из разных сортов чая, которые оценивали на их ингибирующую активность в отношении 3CLPro. Как показано в таблице 1, экстракты черного чая и чая пуэр подавляют активность 3CLPro, в то время как экстракты зеленого чая или чая улун - нет. Мы дополнительно проверили несколько известных компонентов чая, которые могут быть задействованы, включая кофеин, теофиллин, катехин (C), эпигаллокатехин (EGC), (-) - эпигаллокат Катехин галлат (EGCg), эпикатехин (EC), эпикатехин галлат (ECg), TF1, TF2, TF2B, дубильная кислота и TF3. Как показано в таблице 1, результаты показывают, что метилксантины (кофеин и теофиллин) не влияют на активность 3CLPro. Катехины (включая C, EC, ECg, EGC и EGCg), присутствующие в зеленом чае (неферментированном) и чае улун (частично ферментированном), не будут ингибировать активность 3CLPro. Наши результаты показывают, что танины, TF2B и TF3 являются ингибиторами 3CLPro, как показал анализ флуоресцентного субстрата (рис. 3). TF2A не тестировался из-за его недоступности.
Оценка чайных экстрактов и чистых компонентов чая на предмет их ингибирования активности 3CLPro
Поскольку многие другие полифенолы, относящиеся к дубильной кислоте и TF2B, также присутствуют в различных типах чаев, мы решили изучить ингибирование активности различными чайными экстрактами и несколькими хорошо известными чистыми ингредиентами, присутствующими в чаях. Таким образом, водные экстракты из разных типов чая были приготовлены и оценены на предмет их ингибирующей активности против 3CLPro. Как показано в Таблице 1, экстракты из черного чая и чая Пуэр ингибировали активность 3CLPro, в то время как экстракты из зеленого чая или чая улун - нет. Мы дополнительно проверили возможное участие нескольких известных ингредиентов, присутствующих в чаях, включая кофеин, теофиллин, катехин (C), эпигаллокатехин (EGC), (-) - эпигаллокатехин галл (EGCg), эпикатехин (EC), эпикатехин галлат (ECg), TF1, TF2, TF2B, дубильная кислота и TF3. Таблица 1,результаты показали, что метилксантин (кофеин и теофиллин) не влиял на активность 3CLPro; катехины, включая C, EC, ECg, EGC и EGCg, присутствующие в зеленом чае (неферментированном) и чае улун (частично ферментированном), также не подавляли активность 3CLPro. Наши результаты показали, что дубильная кислота, TF2B и TF3 являются ингибиторами 3CLPro, что было выявлено с помощью анализа флуорогенного субстрата (рис. 3). TF2A не тестировался из-за его недоступности.
TF2B и TF3 как эффективные агенты против ингибирующей активности 3CLPro
Библиотека скрининга природных продуктов состоит из простых и сложных кислородных гетероциклов, алкалоидов, семитерпенов, дитерпенов, пентациклических тритерпенов, стеролов и многих других различных представителей. Было обнаружено, что многие полифенолы черного чая (особенно полифенолы TF1, TF2 и TF3) ингибируют 3CLPro. В черном чае содержание TF3 является самым высоким (1,05%), за ним следуют TF2A (0,34%), TF2B (0,11%) и TF1 (0,08%) (16). Интересно, что, как показано на рисунке 3b, TF3 содержит две галлатные группы, присоединенные в положении 3,3 '. С другой стороны, TF2A и TF2B состоят только из одной галлатной группы, присоединенной к 3 или 3'-положению соответственно (рис. 4b). Напротив, к TF1 не присоединяются группы сложного эфира галловой кислоты. Результаты в таблице 1 показывают, что группа сложного эфира галловой кислоты, связанная с 3'-положением TF2B и TF3, может быть важной для взаимодействия с активным сайтом 3CLPro. Активность ЭК, ЭГКГ, ЭКГ и ЭГК (теафлавины 50 ≥ 100 мкМ) намного ниже, чем у теафлавинов.
TF2B и TF3 как сильные агенты против ингибирующей активности 3CLPro
Отобранная библиотека природных продуктов состояла из простых и сложных кислородных гетероциклов, алкалоидов, секвитерпенов, дитерпенов, пентациклических тритерпенов, стеринов и многих других разнообразных представителей. Было обнаружено, что многочисленные полифенолы черного чая (особенно TF1, TF2 и TF3) ингибируют 3CLPro. черный чай, TF3 был самым распространенным (1,05%), за ним следовали TF2A (0,34%), TF2B (0,11%) и TF1 (0,08%) (16). Интересно отметить, что TF3 содержал две галлатные группы, присоединенные к 3 , Позиции 3 ', как показано на рис. 4b. TF2A и TF2B, с другой стороны, состояли только из одной галлатной группы, присоединенной либо к положениям 3, либо к положениям 3', соответственно (рис. 4b). Напротив, галлатная группа отсутствует. был присоединен к TF1. Результаты в таблице 1 показывают, что галлатная группа, присоединенная к положению 3 'к TF2B и TF3,могут быть важны для взаимодействия с активным сайтом 3CLPro ЭК, ЭКГ, ЭКГ и ЭКГ были намного менее активными (IC50 ≥ 100 мкМ), чем теафлавины.
Форум
человеческого коронавируса (HCoV) является основной причиной респираторных заболеваний на животных, включая человека. Доказано, что новый коронавирус может вызвать атипичную пневмонию. Основная протеаза (часто называемая 3C-подобной протеазой (3CLPro)) была идентифицирована как привлекательная лекарственная мишень (17). Среди 720 натуральных продуктов, проверенных в этом исследовании, дубильная кислота (рис. 4а) и TF2B были идентифицированы с помощью протеолитического анализа ВЭЖХ для ингибирования 50% протеолитической активности 3CLPro в концентрации ≤10 мкМ. Дубильная кислота и TF2B являются природными полифенолами чая. Установлено, что дубильная кислота в низких концентрациях может ингибировать протеазы, включая активатор плазминогена тканевого типа, активатор плазминогена урокиназного типа и активность плазмина [13]. В настоящее время производится более 300 видов чая, но они делятся на три основных вида: зеленый чай получают путем сушки свежих чайных листьев, и основное внимание уделяется предотвращению окисления полифенолов чая в процессе производства. Напротив, производство черного чая характеризуется высокой степенью ферментации, которая вызывает серию химических конденсаций между компонентами, присутствующими в чае. Чай улун частично ферментируется, и его состав больше похож на зеленый чай (18). При оценке различных видов чая мы обнаружили, что экстракты нескольких разных видов чая (включая чай пуэр и черный чай) могут подавлять активность 3CLPro, в то время как зеленый чай или чай улун - нет. Однако химические компоненты в чае пуэр очень сложны, и сложно выделить чистые компоненты для структурной идентификации. Очистку и идентификацию ингредиентов чая пуэр следует провести в отдельном исследовании.
Затем мы проверили, могут ли другие известные ингредиенты чая также подавлять активность 3CLPro. Мы обнаружили, что метилксантины (кофеин и теофиллин) и катехины (EGCg, EC, C, ECg и EGC) не подавляли активность 3CLPro в концентрациях до 100 мкМ (Таблица 1). Однако TF1, TF2 и TF3 являются более эффективными ингибиторами 3CLPro, чем катехины зеленого чая. На стадии ферментации при производстве черного чая большая часть катехинов окисляется и конденсируется в теафлавины в результате димеризации и конденсируется в теафлавины в результате полимеризации. Зеленый чай содержит около 30% катехинов (в сухом виде), а черный чай содержит около 9% катехинов и 4% теафлавинов (19). В другом исследовании Leung et al. (16) В отчете говорится, что TF3 имеет самое высокое содержание теафлавина в черном чае (1,05%), за ним следуют TF2A (0,34%), TF2B (0,11%) и TF1 (0,08%). Дубильная кислота - это тип полифенола в растениях, но, поскольку дубильная кислота представляет собой множество полимеров, содержащих моли, ее содержание в зеленом или черном чае трудно определить количественно. wt– 500–3000 Да.
Интересно, что TF2B и TF3 являются более сильными ингибиторами 3CLPro, чем TF1 (таблица 1). В отличие от TF2B и TF3, TF1 не содержит сложноэфирных групп галловой кислоты (рис. 4b). Следовательно, связывание галлатной группы в положении 39 TF2B и TF3 может быть важным для их ингибирующей активности в отношении 3CLPro. Эти результаты показывают, что TF2B и TF3 могут быть хорошей отправной точкой для разработки ингибиторов 3CLPro, кодируемых SARS-CoV, с более высокой активностью.
Наконец, это исследование выявило три соединения (TF2B, TF3 и дубильная кислота), которые являются эффективными ингибиторами 3CLPro (IC50≤10 мкМ). Эти соединения широко представлены в экстрактах черного чая (16, 19). Черный чай - популярный напиток в мире. Результаты этого исследования заслуживают дальнейшего изучения, чтобы изучить влияние этих натуральных продуктов на подавление репликации SARS-CoV в культуре клеток. Кларк и др. Сообщается, что теафлавины, извлеченные из черного чая, могут нейтрализовать коронавирус крупного рогатого скота и ротавирусные инфекции (20). Поэтому в другом исследовании будет очень интересно оценить, может ли употребление черного чая предотвратить или облегчить кишечную форму коронавирусной инфекции, поскольку известно, что SARS-CoV активно размножается в кишечнике.
Обсуждение
Коронавирусы человека (HCoV) являются основными причинами заболеваний верхних дыхательных путей у животных, в том числе человека. Было продемонстрировано, что новый коронавирус вызывает SARS. Основная протеаза, часто называемая 3C-подобной протеазой (3CLPro), была признана привлекательным лекарством. мишень (17). Из 720 натуральных продуктов, проверенных в этом исследовании, дубильная кислота (рис. 4а) и TF2B были идентифицированы с помощью протеолитического анализа ВЭЖХ для ингибирования 50% протеолитической активности 3CLPro при концентрациях ≤10 мкМ. Обе дубильные кислоты и TF2B принадлежат к группе природных полифенолов, содержащихся в чае. Было обнаружено, что низкие концентрации дубильной кислоты ингибируют протеазы, включая активатор плазминогена тканевого типа, активатор плазминогена урокиназного типа и активность плазмина [13]. В настоящее время насчитывается более 300 различных сортов чая. производятся, но их можно разделить на три основных вида:зеленый чай производят путем сушки свежих чайных листьев с упором на предотвращение окисления полифенолов чая в процессе производства. Напротив, производство черного чая характеризуется высокой степенью ферментации, которая приводит к серии химических конденсаций. среди ингредиентов, присутствующих в чае. Чай улун частично ферментирован, и составы чая больше похожи на составы, содержащиеся в зеленом чае (18). При оценке различных типов чая мы обнаружили, что экстракты из нескольких различных типов чая, включая пуэр и черный чай, могут ингибировать активность 3CLPro, в то время как зеленый чай или улун не могут.Однако химический состав чая пуэр очень сложен, и трудно выделить чистые ингредиенты для структурной идентификации.Очистку и идентификацию ингредиентов чая пуэр следует провести в отдельном исследовании.
We next examined whether other well-known ingredients present in tea could also inhibit 3CLPro activity. We found that methylxanthine (caffeine and theophylline) and catechins (EGCg, EC, C, ECg and EGC) were not able to inhibit 3CLPro activity at concentrations up to 100 µM (Table 1). However, TF1, TF2 and TF3 were more potent 3CLPro inhibitors than catechins in green tea. During the fermentation step in the production of black tea, most of the catechins are oxidized and condensed into theaflavins through dimerization and into thearubigins through polymerization. Green tea contains ∼30% of catechins (dry mass base) while black tea contains ∼9% of catechins and 4% of theaflavins (19). In another study, Leung et al. (16) reported that TF3 was the most abundant (1.05%) theaflavin in black tea followed by TF2A (0.34%), TF2B (0.11%) and TF1 (0.08%). Tannic acid is a class of polyphenolic in plants but the quantification of its levels in green or black tea is difficult because tannic acid constitutes a wide range of polymers with mol. wts of 500–3000 Da.
Интересно отметить, что TF2B и TF3 являются более сильными ингибиторами 3CLPro, чем TF1 (таблица 1). В отличие от TF2B и TF3, TF1 не содержит галлатной группы (рис. 4b). Таким образом, добавление галлатной группы, присоединенной на положение 39 для TF2B и TF3 может быть важным для их ингибирующей активности против 3CLPro.Эти результаты предполагают, что TF2B и TF3 могут быть хорошей отправной точкой для разработки более активных ингибиторов для 3CLPro, кодируемого SARS-CoV.
Наконец, это исследование выявило три соединения (TF2B, TF3 и дубильная кислота), которые являются эффективными ингибиторами 3CLPro (IC50 ≤10 мкМ). Эти соединения содержатся в большом количестве в экстракте черного чая (16,19). Черный чай - популярный напиток. Результаты этого исследования требуют дальнейшего изучения влияния этих натуральных продуктов на ингибирование репликации SARS-CoV в культуре клеток. Кларк и др. сообщили, что теафлавины, извлеченные из черного чая, способны нейтрализовать коронавирус крупного рогатого скота и ротавирусные инфекции. (20). Таким образом, будет очень интересно оценить в отдельном исследовании, может ли употребление черного чая предотвратить или облегчить инфекцию кишечной формы коронавируса, поскольку известно, что SARS-CoV активно размножается в кишечном тракте.