На картине изображена казнь Иоанна Крестителя в присутствии Саломеи, приготовившей для его головы золотое блюдо. Стоящая рядом женщина, идентифицируемая как Иродиада или просто случайная свидетельница, с ужасом наблюдает, как надзиратель приказывает палачу довершить казнь отсечением головы Иоанна кинжалом. Данная сцена, популярная у итальянских художников вообще и у Караваджо в частности.
В центре картины на переднем плане простёртый на земле обнажённый Креститель со связанными за спиной руками и перерезанным кровоточащим горлом. Злодейство свершилось, и Иоанн мёртв. Всем своим видом он выражает великое таинство перехода из земного мира в вечность. Прижимая его голову к земле, над ним склонилась крепкая фигура палача, который выхватил из ножен за спиной нож, готовясь обезглавить казнённого. Слева напротив арки тюремщик с ключами на поясе, указывающий палачу, куда положить отрезанную голову. Её собирается принять пригнувшаяся с латунным блюдом в руках простоволосая девушка с высоко засученными рукавами полотняной рубашки, которая никак не походит на Саломею, дочь царя Ирода. Всё выглядит на удивление привычно и буднично, словно по написанному сценарию, и лишь старая седовласая женщина, прижав к лицу руки, чтобы не видеть чудовищное злодеяние, еле сдерживает крик ужаса.
Картина производит впечатление разыгрываемой на подмостках трагедии в приглушённых тонах. Выделяются лишь пурпурная накидка, прикрывающая наготу Крестителя, и ядовито-зелёный цвет куртки тюремшика. Без резких переходов свет плавно скользит по фигурам, оставляя в тени верхнюю часть полотна. Чтобы уравновесить композицию, вытянутую по горизонтали, справа дано мрачное окно, сквозь решётку которого два узника, вытянув шеи, следят за казнью, которая уготована и им. Ничто не поможет бежать из этого каменного мешка — даже опущенный сверху канат, болтающийся над окном и крепко привязанный к кольцу, вмурованному в стену.
Как и прочие работы позднего творчества Караваджо, картина характерна минимумом деталей и реквизита. Размеры полотна позволили изобразить персонажей примерно в натуральную величину, несмотря на то, что значительная часть картины представляет собой пустое пространство.
Согласно книге искусствоведа Джона Варриано «Караваджо: искусство реализма» фоном для картины послужило изображение тюрьмы из уложения о наказаниях Ордена госпитальеров.
«Обезглавливание Иоанна Крестителя» дошла до нашего времени в очень плохом состоянии, пройдя реставрацию только в 1950-е годы к знаменитой выставке в Риме 1955—1956 годов, обратившей к работе значительный интерес.
Во время реставрационных работ на картине была обнаружена подпись автора, символически помещённая им под лужей крови раненного Иоанна, и которая немедленно стала предметом дискуссий. Одни считают, что Караваджо подписался f. Michelang.o (где f означает его принадлежность к братству Ордена), но более распространено мнение, что подпись гласит «Я, Караваджо, сделал это», подразумевая собой признание в преступлении — возможно, в убийстве Рануччо Томассони в 1606 году, из-за которого художнику пришлось бежать из Рима.
Рим постоянно преследовал Караваджо за однажды совершенное им убийство, эта история всегда тяготела над ним. И некоторые считают, что вот таким необычным образом художник принес свое покаяние.