25 мая 1591 года царевич Дмитрий был найден мертвым во внутреннем дворике дворца. Смертельное ранение мальчик получил в шею.
В результате расследования было установлено следующее. Царевич давно страдал приступами «черной немочи» — эпилепсии. Последний припадок произошел за пару дней до трагедии. Затем Дмитрию полегчало, и 25 мая, после посещения обедни, мать разрешила ему погулять во внутреннем дворе.
С царевичем были мамка Василиса Волохова, кормилица Арина Тучкова, постельница Марья Колобова и четверо сверстников Дмитрия, сыновья кормилицы и постельницы Петруша Колобов, Иван Красенский и Гриша Козловский. Мальчишки играли «в тычки» — эта древняя русская игра более всего напоминает так называемые «ножички», в которые играют до сих пор. В общих чертах, суть игры заключается в бросании заостренного металлического предмета (ножа или стержня) в землю определенным образом.
В руке у Дмитрия находился либо нож, либо свайка (заострённый четырёхгранный гвоздь). В этот момент царевича настиг новый приступ эпилепсии. Во время приступа мальчик непроизвольно воткнул острие себе в горло, что и стало причиной смерти.
Окончательный вывод следственной комиссии — царевич Дмитрий погиб в результате несчастного случая. Освященный собор во главе с патриархом Иовом утвердил результаты следствия.