Значительную часть работы Менгеле составляли опыты над заключёнными, включая анатомирование живых младенцев; кастрация мальчиков и мужчин без использования анестетиков; подвергал женщин ударам тока высокого напряжения с целью тестирования их выносливости. Однажды он стерилизовал группу польских монахинь при помощи рентгеновского излучения. За 21 месяц своей работы в Освенциме заработал репутацию одного из самых опасных нацистов, получил кличку «Ангел Смерти». Лично встречал поезда узников, приезжавших в лагерь, и сам решал, кому из них предстоит работать в лагере, кто пойдёт на его опыты, а кто сразу же отправится в газовую камеру.
Особый интерес Менгеле вызывали близнецы. В 1943 году Менгеле выбирал близнецов из общего количества прибывавших в лагерь и поселял их в специальных бараках. Из, по разным оценкам, от 900 до 3 тысяч близнецов (450—1500 пар) выжили порядка 300 человек. Среди его экспериментов были попытки изменить цвет глаз ребёнка впрыскиванием различных химикатов в глаза,