Кому из нас не было интересно, как исследуются ткани и клетки живых организмов? Многие наверняка сталкивались с такой процедурой как биопсия, когда врач забирает на анализ кусочек ткани. Что же с этими тканями делают в лаборатории и как их можно исследовать.
Самый простой способ исследовать ткани и клетки в них — это окрашивание гематоксилином и эозином. Это такие красители, под воздействием которых разные структуры в клетке приобретают различную окраску. Их окраска зависит от того, из чего состоят эти структуры: из ДНК или из белка. Окрашивание гематоксилином и эозином является наиболее популярным и широко используемым в медицинской практике. С его помощью, например, можно определить наличие онкологии или какой-то другой патологии.
Однако на самом деле окрасок, с помощью которых можно исследовать ткани и клетки великое множество. Когда исследователь выбирает тот или иной метод окраски, он должен чётко представлять себе, для чего ему это: например окраска по Маллори позволяет лучше различить структуры соединительной ткани (а точнее — белок коллаген). Немного особняком стоят иммуногисто- и иммуноцитохимические исследования. В данном случае мы выявляем абсолютно конкретные структуры в конкретных клетках или тканях.
Иммуногистохимический метод используется для поиска клеточных или тканевых антигенов, список которых может содержать аминокислоты и белки или конкретные инфекционные агенты. Звучит всё это довольно страшно, но давайте разберёмся.
Методика иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания начала формироваться ещё в 1930-х годах. В 1942 году было опубликовано первое исследование, в котором была применена эта техника. Исследование Coons и его коллег было построено на исследовании пневмококковых антигенов в инфицированных тканях с помощью красителя FITC (флуоресцеин изотиоцианат). С тех пор методика была подвержена значительному апгрейду: были улучшены способы фиксации тканей на стёклах, проведение реакции с антителами, к тому же произошёл значительный прорыв в области микроскопии. В результате всего этого ИГХ окрашивание стало довольно рутинной методикой, которая теперь повсеместно применяется в диагностических и исследовательских лабораториях.
Существуют различные способы проведения реакции: с флуоресцентным красителем или без него, прямой или непрямой. Для того, чтобы понять, как в принципе происходит реакция, нам нужно ввести два понятия:
Антиген — вещество, наличие или отсутствие которого мы выявляем, способное специфически связываться с антителом. Само название никак не связано ни с какими генами, образовано путём сложения частей слов antibody и generator (дословно — генератор, производитель антител). Кроме того, нужно чётко разделять понятие антигена в иммунологии, под которым часто понимают именно потенциально опасные или чужеродные вещества, от понятия антигена в биохимии, когда антигены могут вообще не вызывать никакого иммунного ответа.
Антитело — белок, способный специфически связываться с антигенами, образуется в организме человека или других теплокровных животных в ответ на введение антигена. На практике в лаборатории мы используем мышиные, кроличьи и козьи антитела. Антитела бывают моноклональными и поликлональными. Всё верно, эти слова образовались от слова "клон". Суть вот в чём. Моноклональные антитела — это антитела с конкретной специфичностью к определённому антигену, произведённые иммунными клетками, образовавшимися от одной клетки-предшественницы (то есть "клонами"). Поликлональные антитела образуются в разных клонах иммунных клеток и связываются с разными частями антигенной молекулы. И те, и другие обладают рядом достоинств и недостатков.
Так моноклональные антитела более специфичны (соответственно, дают меньше фонового окрашивания), но сложнее в производстве и не так чувствительны против большого количества антигенов (из-за чего требуется более высокая концентрация). Поликлональные антитела, напротив, легко производить, они более удобны в применении, из-за чего и получили более широкое распространение. Однако они менее специфичны, из-за чего могут давать фоновое окрашивание.
Итак, надеюсь, с антителами и антигенами стало понятно если не всё, то хотя бы часть, поэтому мы можем двинуться дальше. Как я уже сказала, ИГХ окрашивание может быть прямым и непрямым. При прямом методе ИГХ маркированное антитело непосредственно связывается с антигеном, после чего исследователь выявляет его с помощью микроскопии.
Непрямой метод ИГХ окрашивания представляется более сложным, так как окраска проходит в два этапа. Сначала немеченые антитела, которые называют первичными, связываются с антигеном, после чего на препарат наносятся растворы вторичных, уже меченых антител, которые связываются с первичными антителами.
Казалось бы, зачем придумывать велосипед? Зачем строить такую жуткую трёхэтажную структуру в/на клетке? Всё дело в том, что у прямого метода есть значительные недостатки, в первую очередь — это цена, так как производство антител, необходимых для прямого окрашивания, — дорогое удовольствие. Кроме того, не на все антитела можно "повесить" метку. У непрямого метода таких недостатков нет: в нём используются конкретные вторичные антитела с "навешенной" на них меткой. Первичным антителам никакие метки не мешают нормально связываться с антигенами, так что и чувствительность у метода также повышается.
Что же используется в качестве этой метки? В первую очередь, конечно же, флуоресцентные красители, с их помощью получаются невероятно красивые фотографии. В этом случае необходимо обязательно докрасить ядра клеток каким-либо ядерным флуоресцентным красителем (как правило, DAPI, который окрашивает ДНК, находящуюся в ядре). Это нужно для того, чтобы исследователь мог "сориентироваться в клетке": ага, это у нас цитоплазма, тут ядро, а тут — мембрана. У флуоресцентных меток есть определённые недостатки. С их помощью невозможно оценить морфологию (то есть строение) клетки, поэтому часто срезы с одной и той же ткани отправляются одновременно на окраску гематоксилином и эозином и ИГХ окрашивание. Кроме того, флуоресцентные метки достаточно быстро выгорают (покрасил — нужно сразу смотреть), поэтому препараты не имеет смысла долго хранить. На практике я смотрела препараты даже двух- и трёхмесячной давности, но делать по ним какие-то выводы, конечно, бессмысленно. Также специальное оборудование, необходимое для детекции, стоит довольно дорого и может быть не по карману некоторым исследователям. Однако флуоресцентные метки позволяют не только наглядно и красочно представить исследование, но и пометить на одном препарате сразу несколько антигенов (двойная, тройная метка).
Кроме того, возможно связывание с ферментной меткой (это может быть пероксидаза хрена или щелочная фосфатаза) или даже с меткой, содержащей металл (ферритиновая метка, содержащая железо). Ферментные методы основаны на взаимодействии фермента, которым помечены антитела, с исследуемым веществом. В результате их взаимодействия образуется окрашенный продукт реакции, который можно наблюдать в световой микроскоп. Для получения препаратов, которые можно будет хранить долгое время, также используют металлы, например, коллоидное золото. В этих случаях используют световой микроскоп, который намного дешевле флуоресцентного и конфокального.
Протокол окрашивания сильно зависит не только от того, каким образом мы собираемся красить ткань, но и от того, каким именно образом были приготовлены препараты. Это могут быть парафиновые срезы или криосрезы, ткани/клетки могут быть по-разному зафиксированы, в зависимости от этого в протоколе происходят некоторые изменения. Что всегда остаётся неизменным в нашей лаборатории — это нанесение раствора для блокирования неспецифического связывания (протеин-блока). Это раствор, который наносится на препараты перед окрашиванием антителами, под воздействием которого минимизируется вероятность неспецифического связывания антител с другими молекулами, не антигенами.
ИГХ окрашивание — это относительно простой и эффективный способ исследования, однако и у него имеются недостатки. Комитетом по контролю качества иммуногистохимии Французского общества патологии в 1997 году были выявлены две основные проблемы, приводящие к ошибкам в диагностике: неприменение методик поиска антигенов и использование неэффективных методов увеличения количества антител. Обработка, фиксация и доставка образцов в лабораторию также являются определяющими факторами. Образцы, которые оставили надолго в фиксирующем растворе, могут стать непригодными, как говорится, потерять антигенность. Так было показано, что при 12-недельном хранении гистологических образцов рака молочной железы наблюдается значительная потеря антигенности (речь шла об обнаружении белков p53, Bcl-2, рецепторов к экстрогену и фактора свёртывания крови VIII).
Наиболее часто используемым фиксатором является формальдегид с последующим использованием парафином. Некоторые исследователи даже предлагают, чтобы такая процедуры фиксации и хранения стала стандартом, чтобы можно было сравнивать результаты гистологических исследований, полученных в разных лабораториях в разных странах. Однако фиксация с помощью формальдегида может приводить к повреждению некоторых сайтов связывания с антителами или маскировке (когда какие-то другие белки закрывают интересующий нас антиген).
Несмотря на то, что существуют определённые методики демаскировки (например тепловая), весь препарат должен быть достаточно устойчив к такой методике. С некоторыми антителами задержка на стадии фиксации может приводить к значительной потере иммунореактивности. Исходя из этого, можно заключить, что ИГХ окрашивание желательно проводить, не растягивая их на несколько недель. Особенно если планируется использовать флуоресцентную метку.
ИГХ окрашивание, как мы уже узнали, — довольно старый способ исследования, однако это не значит, что учёные не хотят его как-то модифицировать. Важными достижениями стали разработка полуавтоматических машин, помогающих в проведении реакций, а также технология микрочипирования, необходимая для выбора диагностически и терапевтически важных белков для исследования заболеваний (ещё одна статья с фотографиями). Несмотря на высокую стоимость таких технологий, они могут в скором времени стать такой же рутиной, как нынешние методики ИГХ, применяющиеся во многих лабораториях по всему миру.
Бонус 1 — один из протоколов ИГХ окрашивания. Вообще протоколы, как я уже говорила, могут отличаться в зависимости от целей и задач исследователя, однако основные моменты всегда остаются плюс-минус одинаковыми.
Бонус 2 — каталог с продукцией для постановки ИГХ. Не реклама! Из него можно понять, какое нужно оборудование и для чего, а также получить общее представление об этапах постановки реакции.