В мае 1941 года из четырёх первых серийных мортир был создан 833-й дивизион, 1-я батарея которого (в составе мортир «Адам» и «Ева») была передана командованию Группы армий «Юг» для разрушения ДОТов и укреплений «Линии Молотова» в районе Перемышля. 2-я батарея в составе орудий «Тор» и «Один» была направлена в Группу армий «Центр» для обстрела Брестской крепости.
Все четыре установки открыли огонь 22 июня 1941 года, и у артиллеристов сразу же возникли проблемы. У «Одина» и «Тора» в первый же день снарядами заклинило стволы. У «Евы» при движении своим ходом от железнодорожной станции до позиции слетела гусеница, и в последующих боях она не участвовала. «Адам» выпустил только четыре снаряда, после чего в Группе армий «Юг» посчитали нецелесообразным дальнейшее использование этих мортир, и 1-ю батарею отправили обратно в Германию
2-я батарея была удачливее. Несмотря на проблемы, «Тор» и «Один» выпустили по Брестской крепости 31 снаряд, из которых не взорвались только два. На месте разрывов снарядов образовывались воронки диаметром в 30 и глубиной в 5 метров, при взрыве на высоту до 170 метров поднималось облако дыма и пыли. Однако в бетонные укрепления крепости ни один из этих снарядов не попал.
Второй известный эпизод применения мортир «Проекта 040» – борьба с севастопольской 30-й бронебашенной береговой батареей ЧФ. В мае 1942 года при подготовке третьего штурма Севастополя «Тор» и «Один» были доставлены к северному фасу линии обороны города, откуда 6 июня 1942 года начали обстрел батареи. Немецкие артиллеристы смогли вывести мортиру «Тор» на высоту, находившуюся всего в 1200 метрах от передовых позиций защитников Севастополя, откуда 30-я береговая батарея находилась в прямой видимости.
Уже на следующий день расчёту «Тора» удалось попасть бронебойным снарядом в двухорудийную башню №1. За ночь гарнизон батареи восстановил башню, но с этого момента она могла вести огонь только из одного орудия. Ещё один снаряд попал в железобетонный монолит орудийного блока батареи, от чего тот треснул, а также вышла из строя фильтр-вентиляционная установка. Несмотря на эти успехи, полностью вывести батарею из строя мортиры не смогли.
По некоторым данным, командиру 30-й батареи капитану Г.А. Александеру удалось засечь местоположение «Тора» и «Одина» и накрыть их контрбатарейным обстрелом. Разнятся и данные по количеству снарядов, выпущенных мортирами под Севастополем. Минимальное упоминаемое количество – 122 снаряда, из которых, по советским данным, не разорвалось или распалось на несколько крупных кусков до 40%.
О дальнейшей судьбе мортир «Проекта 040» известно мало. После капитального ремонта, по крайней мере, на трёх мортирах («Локи», «Торе» и, скорее всего, «Фенрире») стволы были заменены на другие — калибром 540 мм и длиной в 11,5 калибров. Это увеличило дальность стрельбы орудий с 4 до 10,4 км.
В 1944 году мортира «Циу» обстреливала Варшаву, жители которой подняли восстание. 28 августа один из снарядов мортиры попал в здание отеля «Прудентиаль» — по состоянию на 1934 год второе по высоте здание в Европе. Если бы снаряд разорвался внутри гостиницы, то она бы, наверняка, рухнула, но взрыв произошел снаружи, и здание устояло. После войны его перестроили и в 1954 году там открылась гостиница «Варшава», сохранившаяся до наших дней.
Мортиры «Локи», «Тор», «Один» и «Вотан» (бывшая «Ева») участвовали в обороне Нормандии, но перелома в ситуацию на фронте внести не смогли.
Летом 1944 года союзная авиация повредила «Тор», а в начале 1945 года «Вотан» (бывшая «Ева»), «Локи» и «Один» были взорваны отступавшими немецкими войсками. Их обломки достались американцам, так же как и прототип «Карлов» — мортира «Фенрир». Мортиру же с номером VI захватила Красная Армия, и сейчас она является экспонатом Музея бронетанковых войск в Кубинке. Первоначально считалось, что это установка «Циу». Однако, когда через несколько десятилетий было решено перекрасить мортиру, то под слоями старой краски была обнаружена надпись «Адам». Почему на одной установке оказалось два различных обозначения, какое из орудий на самом деле экспонируется в Кубинке и куда делась последняя, седьмая мортира, неизвестно до сих пор.