При окрашивании негативными красителями среда, в которой находятся микроорганизмы, становится полупрозрачной; в результате микроорганизмы, в которые краситель не проникает, выглядят как светлые частицы на равномерно темном фоне. Микроорганизмы и структуры, плохо выявляемые с помощью позитивных красителей, например спирохеты и внеклеточная слизь, легко выявляются при окрашивании негативными красителями. Споры имеют вид преломляющих свет включений в вегетативных клетках.
Окрашивание негативными красителями можно вести двумя способами: либо краситель наносят на сухой фиксированный мазок и дают раствору красителя высохнуть, либо на край стекла наносят по капле раствора красителя и суспензии бактерий, после чего обе капли смешивают и, не давая смеси высохнуть, проводят мазок вдоль стекла. В результате получается мазок, толщина которого уменьшается в направлении движения, так что всегда можно найти участок с подходящей плотностью окраски.
Негативные красители
Чаще всего для негативного окрашивания используют тушь, 10%-ный (вес/объем) водный раствор нигрозина или 2%-ный (вес/объем) водный раствор конго красного. Нигрозин представляет собой смесь желтого и синего красителей; он окрашивает фон в черный цвет. После окрашивания конго красным высушенные мазки следует погрузить в 1%-ный (по объему) раствор НСI в абсолютном этаноле, в результате чего фон красится в темно-синий цвет.
Комбинация негативного и позитивного окрашивания
Негативное окрашивание можно комбинировать с позитивным. Однако нигрозин не пригоден для комбинированного окрашивания, ибо он обесцвечивает многие красители. Один из методов комбинированного окрашивания состоит в том, что микроорганизмы суспендируют в капле 2%-ного (вес/объем) водного раствора конго красного, сушат на воздухе и затем докрашивают в течение 1-2 мин в кислом фуксине. Фиксация не требуется. Под влиянием кислой среды красителя фон становится синим.
Конго красный окрашивает лишь убитые, но не живые микроорганизмы. Пользоваться этим методом для выявления капсул не рекомендуется.
Кислый фуксин по Мейнвалу
5%-ный (вес/объем) водный раствор фенола - 30 мл
Ледяная уксусная кислота, разбавленная дистиллированной водой 1:5 - 8-10 мл
30%-ный (вес/объем) водный раствор хлорного железа – 4 мл
1%-ный (вес/объем) водный раствор кислого фуксина - 1-2 мл