Пандемия SARS-CoV-2 во многом похожа на десятки других мировых эпидемий, известных истории медицины. Но есть и различия – технический прогресс дал нам беспрецедентные возможности для своевременного выявления переносчиков инфекции.
Полимеразная цепная реакция и ранее была “золотым стандартом” диагностики инфекционных болезней, благодаря своей точности, специфичности и чувствительности. Открытие ПЦР привело к революции в медицине, молекулярной биологии и науке в целом, по значимости это событие можно смело сравнить с первым полетом в космос. Тем удивительнее тот факт, что полимеразную цепную реакцию открыл один человек, а не целый научно-исследовательский институт.
За открытие метода полимеразной цепной реакции американский биохимик Кэри Муллис был удостоен Нобелевской премии 1993 года по химии. Историю открытия ПЦР неоднократно описывали в книгах и статьях как результат классического мозгового штурма, с громким выкриком “Эврика!” в конце. Разница в том, что Архимед, по легенде, в этот момент лежал в ванне, а Кэри Муллис находился за рулем, направляясь в пятничный вечер в свою лесную хижину, чтобы провести выходные с подругой.
Принцип диагностики инфекционных заболеваний с помощью полимеразной цепной реакции
ДНК или дезоксирибонуклеиновая кислота – основа жизни на нашей планете. Именно в молекуле ДНК зашифрован генетический код, определяющий свойства живого организма. Для каждого вида характерны свои уникальные гены, не встречающиеся у других вирусов, бактерий или животных.
Каждый ген состоит из последовательности нуклеотидов – аденина, гуанина, цитозина, тимина (или урацила, если речь идет о РНК). По сути гены – это инструкции по сборке белков. Белки, в свою очередь, служат основной структурно-функциональной единицей, посредством которой реализуются свойства живого организма. Одна последовательность – один ген – один белок, структура которого закодирована в ДНК или РНК.
Коронавирус, вызывающий КОВИД-19, как и любой другой вирус, имеет собственные белки. Например, S белок, образующий шиповидные выросты на поверхности нуклеокапсида, похожие на лучи короны (давшие название семейству). S белок кодируется соответствующим геном, уникальным для SARS-CoV-2 как отпечатки пальцев для преступника. Логично, что, если бы мы могли обнаружить наличие последовательности нуклеотидов, соответствующих уникальному гену S белка, в мазке из верхних дыхательных путей, это событие было бы равнозначно обнаружению самого возбудителя. Подобным образом обнаружение отпечатков пальцев на орудии убийства однозначно указывает на человека, совершившего преступление.
На практике выделить из мазка последовательность нуклеотидов, соответствующих целевому гену, невозможно. К примеру, геном коронавируса SARS-CoV-2 состоит из 30 тысяч нуклеотидов, а ген, кодирующий шиповидный белок, состоит из 1273 нуклеотидов. В мазке, взятом у больного, помимо генома коронавируса, будет присутствовать и человеческая ДНК (3,2 миллиарда пар нуклеотидов), ДНК и РНК других вирусов, бактерий и грибков, обитающих на слизистой верхних дыхательных путей даже у здорового человека. Как обнаружить в этой куче генетической информации короткую последовательность, кодирующую S белок коронавируса?
Для решения этой проблемы можно сделать столько копий целевого гена, чтобы общего количества ДНК хватило для исследования стандартными лабораторными методами. До открытия полимеразной цепной реакции с этой целью использовали клонирование – извлекали из образцов нуклеиновые кислоты, переносили их в бактериальные клетки, размножали их на протяжении нескольких недель для накопления ДНК, и только потом получали результаты. При этом не приходилось говорить ни о скорости, ни о экономичности. Полимеразная цепная реакция позволила сократить это время с месяца кропотливой работы до 2-3 часов в полностью автоматическом режиме. В чем заключалось открытие Муллиса?
Как биохимик он прекрасно знал, как происходит репликация (удвоение) ДНК и синтез белка. Перед копированием части или всей молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты специальные ферменты расплетают и разделяют её на две отдельные нити. Соответственно, чтобы иметь возможность скопировать целевой ген, сначала нужно сделать то же. Для этого можно было использовать ферменты, но Муллис решил просто нагреть образец до 95 градусов по Цельсию. При такой температуре ДНК денатурирует, так же распадаясь на две отдельные цепочки.
Своё открытие Муллис сделал, работая биохимиком в компании "Cetus". Его наняли для того, чтобы он синтезировал короткие цепочки ДНК, которые называются олигонуклеотидами. Для этого использовался специальный фермент - ДНК-полимераза, сшивающий нуклеотиды в одну цепь. Однако полимераза не может синтезировать ДНК на пустом месте - ей обязательно нужна затравка для синтеза в виде короткой цепочки уже существующих нуклеотидов. Подобные затравки называют праймерами.
До изобретения ПЦР ученые использовали один праймер. Муллис придумал использовать два праймера, отмечающие начало и конец целевой последовательности ДНК. В результате ДНК-полимераза будет наращивать цепь нуклеотидов зеркально каждой из двух цепей ДНК, создавая копию целевого гена по принципу комплементарности (аденин=тимин, цитозин=гуанин). Достаточно добавить в раствор сам фермент и "кирпичики", из которых будет собираться копия - аденозин, тимин, гуанин и цитозин (нуклеотиды).
Итак, после завершения элонгации, в растворе находятся две отдельные цепи ДНК, и две копии целевого гена. Хорошо, но мало - количества ДНК все еще недостаточно для использования обычных лабораторных методов. Что же делает Муллис? Просто повторяет цикл сначала!
Бинго! ПЦР позволяет получить столько ДНК, сколько необходимо для установления диагноза. Процесс, ранее занимавший недели и месяцы, теперь укладывается в 2-3 часа.
В базовой версии все манипуляции с пробирками приходилось делать вручную. Кроме того, в раствор после каждого цикла нужно было добавлять ДНК-полимеразу - при нагреве до 95 градусов она разрушалась. Но уже через 2 года обычную ДНК-полимеразу заменили на TAQ-полимеразу - эта версия фермента была извлечена из бактерии Thermus aquaticus, обитающей в гейзерах Йеллоустонского национального парка. ТАГ-полимераза не разрушается даже при нагреве до 95 градусов, сохраняя активность с первого и до последнего цикла.
После публикации работы Муллиса к этой теме подключились другие ученые. Процесс был усовершенствован. Как? Конечно с помощью компьютеров - в конце 80 годов информационные технологии переживали взрывной рост. Контроль над проведением ПЦР передали микропроцессору. Теперь компьютер следил за ходом реакции, регулировал температуру и регистрировал процесс накопления копий целевого гена в реальном времени (так называемая количественная ПЦР). Появились готовые тест-системы для диагностики любых инфекций. Врачи получили возможность загружать в прибор - его назвали амплификатор - сотни пробирок с кровью, сывороткой, мазками, спинномозговой жидкостью, мочой за один раз.
Полимеразная цепная реакция также используется для диагностики генетических или онкологических заболеваний. Нет никакой разницы, какой ген искать - принадлежащий вирусу или самому больному. Достаточно создать нужную пару праймеров, соответствующих дефектному гену, вызвавшему рост опухоли или наследственное заболевание, и провести анализ. ПЦР также используется для установления отцовства и родства, анализа ДНК в интересах расследования тяжких преступлений.
Принцип действия ПЦР объясняет высокую точность, чувствительность и специфичность метода. Именно за эти качества полимеразная цепная реакция и заслужила “звание” “золотого стандарта” диагностики инфекций, онкологических и генетических заболеваний. Именно по этой причине ПЦР широко используется для диагностики COVID -19 как самый точный и достоверный метод. Если в образцах отсутствует целевой ген, реакция невозможна. Тем не менее, ничего 100% в мире нет, даже для ПЦР характерен некоторый процент ложноположительных и ложноотрицательных результатов. О том, почему это происходит, мы поговорим в следующей статье, касающейся точности полимеразной цепной реакции в диагностике КОВИД-19.
Источники:
Polymerase Chain Reaction (PCR)
The PCR Test for Covid-19 Has a Fascinating History