Техника безопасности при работе в лаборатории
- Проводимые ниже методики применяются для проверки предварительного определения бруцелл в исследуемом материале или изолятах
- Работа с исследуемым материалом (подготовка, выполнение анализов) должна вестись с лабораторном халате и перчатках
- Рекомендуется работать в защитных очках или щитках для защиты глаз
- Запрещается совершать какие-либо действия, при которых кисти или пальцы рук могут коснуться слизистых оболочек – в т. ч. принимать пищу, пить, курить, пользоваться косметикой
- Прежде чем покинуть рабочее помещение необходимо вымыть руки
Введение
- Предварительное определение бруцелл осуществляется по морфологическим, культуральным и серологическим признакам
- Для окончательного подтверждения определения необходим ряд конкретных биохимических или молекулярных анализов
- Для контроля культур крови часто используют соответствующие автоматизированные системы. Тем не менее для идентификации позитивные культуры крови приходится субклонировать
- Выделение бруцелл из молочных продуктов на селективных средах
- Выделение бруцелл путем искусственного заражения лабораторных животных. Для выявления бруцелл издавна используют морских свинок
Материал на посев
- Молоко и молочные продукты
- Кровь
- Влагалищные мазки
- Плодные оболочки
- Абортивный материал
- Ткани животных
Определение бруцелл
Предварительное определение
- Окрашивание по Граму
- Оксидазная активность
- Уреазная активность
- Каталазная активность
- Агглютинация в акрифлавине
Определение бруцелл по фенотипическим признакам для биотипирования
- Потребность в углекислом газе
- Образование сероводорода
- Рост на средах с красителями
- Агглютинация в моноспецифичной сыворотке
- Образование геля
- Лизис фагом Тбилиси
Окрашивание по Граму. Теоретические основы
- В основе метода лежит способность микроорганизма удерживать кристаллвиолет при промывке растворителем
- Микроорганизмы, не удерживащие кристаллвиолет, доокрашивают основным фуксином или сафранином О
Принцип метода
- На поверхности бактерий есть пептидогликановые слои и липидные слои
- В эти слои и проникает кристаллвиолет
- Для фиксации красителя добавляют иод
- Этиловый спирт и ацетон растворяют липиды и обезвоживают клеточную мембрану
- Производится докрашивание основным фуксином или сафранином О
Откуда берётся лиловая и розовая окраска
- У грамположительных микроорганизмов мощный слой пептидогликанов и мало липидов
- В этом слое и задерживается смесь кристаллвиолета с иодом при отмывке красителя (синее окрашивание), тогда как у грамотрицательных микроорганизмов она смывается и они остаются прозрачными
- Прозрачные грамотрицательные микроорганизмы докрашивают основным фуксином или сафранином О, в результате чего они приобретают розовую окраску
Наблюдение за окрашиванием
- Грамположительные
Синее или фиолетовое окрашивание
Bacillus anthracis, Clostridium spp.
- Грамотрицательные
Розовое окрашивание
E. coli, Brucella spp.
- Рассматривать препарат с масляной иммерсией
Порядок работы (1)
- Стерильной зубочисткой или петлёй на чистом предметном стекле приготовить жидкую однородную эмульсию микроорганизма либо в физрастворе с фосфатным буфером (PBS), либо просто в физрастворе
- Просушить воздухом
- Зафиксировать мазок
- Абсолютизированный метиловый спирт – взяв свежий спирт, погузить препарат на 1–2 мин в метанол
- Прежде чем приступать к крашению, просушить препарат воздухом и скатить водой из-под крана
- Примерно через 30 мин слить метиловый спирт из-под тяги в отходы
Порядок работы (2)
- Залить зафиксированный мазок первым красителем (кристаллвиолет) на 1 мин
- Смыть кристаллвиолет осторожно скатив препарат холодной водой из-под крана
- На 1 мин залить препарат закрепителем (стабилизироваными иодом для окраски по Граму); при необходимости подбавлять закрепитель, чтобы он покрывал весь мазок
- Смыть закрепитель обесцвечивателем или составом для докрашивания (трёхстадийный сафранин S); не смывайте иод водой!
- Прилить еще обесцвечивателя (состава для докрашивания) и дать прокраситься в течение 20–50 с
- Удалить обесцвечиватель (состав для докрашивания) осторожно промыв препарат холодной водой из-под крана
- Дать просохнуть на воздухе
Готовый набор
- Каталог фирмы Fisher, № B12533 (набор для трёхстадийного крашения по Граму – 3 Step Gram Stain Kit-S, № S71297 по каталогу); препараты положительного контроля можно заказать или сделать самим вместе с препаратами исследуемого материала
- Препараты бруцелл (как из подтвержденного, так и из предполагаемого микробиологического материала) изготавливаются в вытяжном шкафу. Вынимать их из-под тяги для крашения у раковины можно лишь зафиксировав их сначала абсолютизированным метиловый спиртом или нагреванием
Окрашивание чистых культур по Граму
Окрашивание крови по Граму
Литература
- Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals [МЭБ. Руководство по диагностическим пробам и вакцинам для наземных животных] Изд-е 5-е. 2004. МЭБ. Париж
- Alton G. G. et al. Techniques for the brucellosis laboratory . WHO/INRA, Paris [Алтон Г. и др. Методы работы с бруцеллёзом в лаборатории // Изд-е ВОЗ и Нац. НИИ сельского хоз-ва Франции. Париж]
- Manual of Clinical Microbiology [Руководство по клинической микробиологии] Т. 1. Изд-е 8-е. 2003. ASM Press. Вашингтон