Промоутеры - не единственные элементы, необходимые для транскрипционного регулирования. Сочетание различных элементов регуляции, таких как промоторы, энхансеры, интроны и сигналы полиаденилирования, путем создания гибридных последовательностей позволяет модулировать уровни экспрессии.
На уровни экспрессии трансгена может сильно влиять быстрое эпигенетическое глушение экзогенных промоторов. Для защиты промотора и всей кассеты экспрессии от гетерохроматизации были протестированы изоляторные элементы на их способность поддерживать транскрипционно компетентные целые порции ДНК, независимо от типа ткани и места интеграции.
Как подробно рассматривалось в других источниках, эти защитные элементы подразделяются на усиливающие блокирующие изоляторы, функция которых опосредуется CTCF-связывающим фактором, и барьерные изоляторы, механизм действия которых менее известен.
Первый хорошо охарактеризованный изолятор для позвоночных, полученный из куриного β-глобинового локуса, связанного с конститутивной ДНК I, гиперчувствительной площадкой-4, называемой cHS4. cHS4 проявляет как усиливающую блокирующую активность, так и барьерную активность. Многие исследования, касающиеся доставки ретровирусных векторов, показали, что включение элемента cHS4 позволяет увеличить экспрессию трансгена.
Другие, такие как вездесущий элемент открытия хроматина (UCOE), полученный из локуса HNRPA2B1-CBX3 человека (A2UCOE), демонстрируют повышенную стабильность экспрессии трансгена, главным образом, за счет устойчивости к сайленсингу опосредованного метилированием гена ДНК. К другим рассматриваемым элементам относятся элементы-усилители, вставка которых существенно влияет на уровни экспрессии трансгена.
Часто в генной инженерии используется CMV-экспансер (eCMV), присутствие которого в культивируемых клетках сильно повышает экспрессию трансгена под контролем промотора PDGF-β (тромбоцитарного фактора роста-β), что обеспечивает эффективную нейроспецифическую экспрессию генов.
Индуктивные промоторы
Для многих приложений желательно модулировать выражение трансгена путем его включения или выключения. Нерегулируемая длительная сверхэкспрессия некоторых трансгенов может привести к побочным эффектам в ЦНС, таким как аберрантная реорганизация тканей и активация компенсаторных путей и/или инактивация/насыщение активированных путей. Более тонкая регуляция может быть достигнута с помощью индуцибельных промоторов.
Эти системы достигаются путем включения в вектор (или в отдельный вектор) кассеты, управляющей конститутивной экспрессией транскрипционного фактора (трансактиватора), способного активировать или блокировать экспрессию трансгена в зависимости от наличия растворимой молекулы, которая может быть введена системно.
Система регулирования Tet On/Tet Off
Часто используемая система регулирования основана на механизме сопротивления тетрациклина в прокариотах. Доступны два варианта (рис. 3), оба полагаются на тетрациклин для деактивации (система Tet-off) или активации экспрессии гена (Tet-on). В системе Tet-off трансген находится под транскрипционным контролем тет-оператора (tetO) - фрагмента ДНК, чутко реагирующего на трансактиватор tTA, состоящего из тет-репрессора (tetR), слитого с трансактивационным доменом вирусного белка VP16.
Трансген экспрессируется только тогда, когда tTA связывает tetO в отсутствии доксициклина, аналога тетрациклина. В противном случае, наличие тетрациклина или его аналога в культуральной среде или в организме обратимо заставляет трансактиватор отсоединиться от оператора, что приводит к "выключению" трансгена.
Система Tet-on была разработана путем индуцирования случайных мутаций в tetR. В результате одной мутации получается белок с противоположной функцией, получивший название обратного тет-репрессора (rtetR). Этот мутирующий белок при слиянии с доменом трансактивации VP16 (обратный трансактиватор, rtTA) приводит в действие трансгеновую экспрессию только в присутствии доксициклина.
Регуляторные системы на основе тетрациклина обладают большим потенциалом для применения в генной терапии. Они обеспечивают быструю индукцию in vivo или кинетику ингибирования, а тетрациклин с низкой токсичностью и его производные десятилетиями используются для антимикробной активности.
Ограничения в основном обусловлены высокой экспрессией базального трансгена, в частности, когда экспрессия определяется конститутивным промотором. Недавно было обнаружено второе поколение тетрациклин-регулируемой системы, содержащей укороченный минимальный промотор CMV, что повышает эффективность регуляции и демонстрирует низкую базальную экспрессию.
Продолжение следует...