В IV веке до н. э. Ахеменидская империя пала под ударами армии Александра Македонского. В 329 году до н. э. Александр захватил Бактрию и занял столицу Согда — Мараканду (современный Самарканд). Возглавивший местное население Спитамена поднял восстание против македонцев, с которым завоеватели, несмотря на жестокие карательные меры, не могли справиться вплоть до убийства Спитамена кочевниками в 328 году до н. э. Стремясь закрепить свою власть над Согдом, Александр строил новые и восстановил старые города, заселяя их смешанным греко-согдийским населением.
Уже в конце V века до н. э. Хорезм обрел независимость от Ахеменидов, и в IV веке до н. э. царь Хорезма Фарасман вёл в 328 году до н. э. переговоры с Александром Македонским о совместном походе на Колхиду. В последующие столетия Хорезм переживал расцвет: расширялись оросительные системы, были построены новые города Базар-кала и Джанбас-кала, культовые центры, развивались ремесло и искусство. Во II веке до н. э. страна попала под верховную власть кочевого государства Кангюй.
Согд после смерти в 323 году до н. э. Александра Македонского вошёл в состав государства Селевкидов, основанного одним из его военачальников — Селевком I, женатым на Апаме - дочери Спитамена. В 250 году до н. э. от державы Селевкидов отпало Греко-Бактрийское царство. В эту эпоху в Бактрии расцвела эллинистическая культура. Прогрессировало ремесленное производство, росли города. Совершенствовались полеводство, садоводство и виноградарство. На территории Ферганы было государство Давань, а позже Паркана, где выращивались рис, пшеница, виноград и люцерна, возникло и развилось виноделие.
В последующие десятилетия Согд был завоеван кочевым племенем юэчжей. Огромная Кушанская держава включила в свой состав южную Среднюю Азию, часть современного Афганистана и Северную Индию. Его царь Канишка принял буддизм. В I—III веках города Средней Азии превратились в центры административной жизни, ремесла и торговли. Через территорию современного Центрального Узбекистана и Фергану протянулся один из основных маршрутов Великого Шелкового пути.
В Хорезме правила собственная династия с центром в городище Топрак-кала, а затем — в Кяте (ок. современного города Беруни). Население исповедовало местную форму зороастризма, а также буддизм и христианство. Согдийские купцы и буддийские монахи вели активную деятельность в Китае и Индии.