Рис является самой важной культурой, поскольку он служит источником пищи и энергии для людей, при этом около 90% мирового производства риса приходится на Азию. Заболевание рисовым взрывом, вызванное грибком Magnaporthe oryzae, является одним из самых разрушительных заболеваний риса. Симптомы или повреждения можно обнаружить на всех частях растения, включая листья, воротник, шею и паникулубу. Эпидемии взрыва риса происходят в большинстве провинций на севере и северо-востоке Таиланда, где наиболее эффективным методом борьбы с вредителями риса и борьбы с ними является использование устойчивых сортов риса. Сообщается, что зародышевая плазма риса в Таиланде характеризуется высоким уровнем генетического разнообразия. Многие местные сорта риса в Таиланде содержат экзотические генетические материалы, которые помогают адаптироваться к неблагоприятной окружающей среде и обеспечивают устойчивость к насекомым и болезням, включая взрывные заболевания. В течение последнего десятилетия селекционеры из департамента риса Таиланда использовали ген пика в качестве источника устойчивости к взрывам риса для получения нескольких улучшенных сортов риса. Белок устойчивости Pik непосредственно взаимодействует с соответствующим эффекторным белком Avr-Pik, вырабатываемым патогеном, что приводит к реакции защиты хозяина.
Растительные материалы
Из зародышевой плазмы тайского риса было исследовано в общей сложности 373 сорта риса, включая 96 сортов риса из Северного Таиланда, 90 сортов риса из Южного Таиланда, 89 сортов риса из Центрального Таиланда, 77 сортов риса из Северо-Восточной части Таиланда и 21 улучшенный сорт риса.
Извлечение геномной ДНК
Геномная ДНК была извлечена из образцов незрелых листьев по модифицированному протоколу Дойла и Дойла. Каждый образец листа измельчали в жидкий азот, а затем добавляли и выдерживали при 65 °C в течение 60 мин. при температуре 10 мМ Трис-HCl pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 2% SDS, бромистый буфер цитилтриметилмония. Хлороформ-изоамильный спирт добавляли для заполнения трубки и перемешивали путем встряхивания в течение 2-3 мин, затем центрифугировали при 12 000 об/мин и 25 °C в течение 10 мин. Затем водную часть переносили в новую трубу и добавляли 1 мл изопропанола холодного льда, несколько раз осторожно переворачивая трубку, а затем инкубировали в течение ночи при температуре 4 °C. После инкубации образец центрифугировали при 12 000 об/мин и 25 °C в течение 10 минут и промывали 70% этанолом. Раствор был выброшен, и ДНК высохла в течение 5 минут, перед добавлением 100 мкл буфера ТЭ и хранением образца ДНК при 4 °C.
Идентификация гена устойчивости к взрывам риса "Пик".
Амплифицированные продукты ПЦР переваривались рестрикционным ферментом PstI для идентификации группы генов устойчивости Pik. Если амплифицированные продукты ПЦР могут перевариваться ферментом PstI, то ген устойчивости Pik относится к группе Pikp. Если амплифицированные продукты ПЦР не усваиваются ферментом PstI, ген устойчивости Pik относится либо к группе Pikm, либо к группе Piks. Общий объем реакции сбраживания составил 10 мкл, который состоял из 8 мкл продуктов ПЦР, 1 мкл буфера сбраживания и 1 мкл рестрикционного фермента PstI.
Для этапа секвенирования в данном исследовании были разработаны праймеры Pikm_F и Pikm_R. Реакция ПЦР проводилась в общем объеме 10 мкл, состоящей из 6,65 мкл стерильной дистиллированной воды, 1 мкл буфера 10xPCR A, 0,25 мкл 50 мкл MgCl2, 1 мкл смеси 1 мкл dNTPs, 0,1 мкл 5 единиц/мкл ДНК-полимеразы Така и 0,5 мкл ДНК риса. ПЦР определяли с помощью 1%-ного агарозного гелевого электрофореза при 100 В в течение 30 мин, окрашивали бромистым этидием.
Распределение гена устойчивости к Pik в зародышевой плазме риса в Таиланде
Двадцать девять из 373 тайских сортов риса дали продукт амплификации из праймера гена Pik, который представлял собой продукт ПЦР приблизительно 1200 б.п. Четырнадцать сортов риса были из Северного Таиланда. Шесть сортов риса были произведены в южной части Таиланда. Три сорта риса были северо-восточного Таиланда. Два сорта риса были выращены в центральной части Таиланда и четыре риса были улучшенными сортами риса. В качестве положительного контроля использовался сорт риса Jao Hom Nin, известный как сорт, содержащий ген Pik.
Анализ гена устойчивости к пику
Для определения аллеля гена устойчивости Pik все 29 продуктов ПЦР из тайских сортов риса были перевариты с помощью ограничивающего фермента PstI. Продукты ПЦР из 25 тайских сортов риса могут усваиваться ограничительным ферментом PstI с размером продукта 1000 и 200 б.п. Этими 25 тайскими сортами риса были: Pha peing, Nhew san pha tong, Poung Pa yeom, Hom ta krai, Chong re, Bao nam kaang, Hoa na, Nhew hom dam, Hom, Tong hom, Paer nai khaw, Feung kum, Siw helk, Люн, Хо Хо, Или мэ ма, Бичу Ким Сееа, Джа Ну Наир Нейр, Хом, Ай Нон, Хау, Нхью Убон 2, Хоу Джао до Фицанулока 1, Фицанулок 80 и RD35. Усиление ПЦР продуктов из четырех сортов риса не может быть переваримо ферментом ограничения PstI.
