В последние годы царствования Пётр сильно болел (предположительно, почечнокаменная болезнь, осложнённая уремией). Летом 1724 года его болезнь усилилась, в сентябре он почувствовал себя легче, но через некоторое время приступы усилились. В октябре Пётр отправился осматривать Ладожский канал, вопреки советам своего лейб-медика Блюментроста. С Олонца Пётр проехал в Старую Руссу и в ноябре водой поехал в Санкт-Петербург. У Лахты ему пришлось, стоя по пояс в воде, спасать севший на мель бот с солдатами. Приступы болезни усилились, но Пётр, не обращая на них внимания, продолжал заниматься государственными делами. 17 (28) января 1725 года ему стало так худо, что он распорядился поставить в соседней со своей спальней комнатой походную церковь, а 22 января (2 февраля) исповедался. Силы начали оставлять больного, он уже не кричал, как прежде, от жестокой боли, но только стонал.
27 января (7 февраля) были амнистированы все осуждённые на смерть или каторгу (исключая убийц и уличённых в неоднократном разбое). В тот же день в исходе второго часа Пётр потребовал бумаги, начал было писать, но перо выпало из его рук, из написанного смогли разобрать только два слова: «Отдайте всё…». Царь велел позвать тогда дочь Анну Петровну, чтобы она писала под его диктовку, но когда она пришла, Пётр уже впал в забытьё. Рассказ о словах Петра «Отдайте всё…» и приказе позвать Анну известен только по запискам голштинского тайного советника Г. Ф. Бассевича; по мнению Н. И. Павленко и В. П. Козлова, он представляет собой тенденциозный вымысел с целью намекнуть на права Анны Петровны, жены голштинского герцога Карла Фридриха, на российский престол[60].
Когда стало очевидно, что император умирает, возник вопрос, кто займёт место Петра. Сенат, Синод и генералитет — все учреждения, не имевшие формального права распоряжаться судьбой престола, ещё до смерти Петра собрались в ночь с 27 января (7 февраля) на 28 января (8 февраля) чтобы решить вопрос о преемнике Петра Великого. В зал заседаний проникли гвардейские офицеры, на площадь вышли два гвардейских полка, и под барабанный бой войск, выведенных партией Екатерины Алексеевны и Меншикова, Сенат принял единогласное решение к 4 часам утра 28 января (8 февраля). Решением Сената трон наследовала жена Петра, Екатерина Алексеевна, ставшая 28 января (8 февраля) 1725 года первой российской императрицей под именем Екатерина I.
В начале шестого часа утра 28 января (8 февраля) 1725 года Пётр Великий скончался в страшных мучениях в своём Зимнем дворце у Зимней канавки, по официальной версии, от воспаления лёгких. Похоронен он был в соборе Петропавловской крепости в Санкт-Петербурге. Вскрытие показало следующее: «резкое сужение в области задней части мочеиспускательного канала, затвердение шейки мочевого пузыря и антонов огонь». Смерть последовала от воспаления мочевого пузыря, перешедшего в гангрену на почве задержки мочи, вызванной сужением мочеиспускательного канала.[61]
Знаменитый придворный иконописец Симон Ушаков написал на кипарисной доске образ Живоначальной Троицы и апостола Петра. После смерти Петра I эта икона была установлена над императорским надгробием[62].